UABDivulga - Barcelona recerca i innovació

A la primera part d'aquesta tesi doctoral es va desenvolupar un nou elèctrode fet amb pasta de grafit-exposi composite (GECE), i al qual es va afegir nitrat de bismut [Bi(NO₃)₃ ] com a precursor de bismut incorporat [Bi(NO₃)₃-GECE)], com a una possible alternativa per a l'anàlisi electroquímica per redissolució de traces de metalls pesants (Veure Figura 1).

Es van portar a terme mesures individuals i simultànies de Pb i Cd, i els resultats obtinguts van mostrar clarament els avantatges del [Bi(NO₃)₃-GECE] en combinació amb la tècnica de voltamperometria de redisolució anòdica d'ona quadrada (SWASV), per a la detecció de metalls pesats. Amb l'ús del [Bi(NO₃)₃-GECE] construït, es poden realitzar anàlisis ràpides i eficaces d'ions de traces de metalls, com per exemple Pb i Cd, en mostres ambientals de sòl, aigües naturals i aigües residuals. L'avantatge inherent de la no necessitat de mercuri elimina moltes de les objeccions per a l'ús de mètodes electroquímics en la detecció de tals espècies en aquests mitjans. La superfície de l'elèctrode es pot polir després de cada mesura i és possible usar-la en altres mesures amb els mateixos resultats eficients, ja que l'elèctrode és molt robust.

Quan es va comparar el [Bi(NO₃)₃-GECE)] amb l'elèctrode de pel·lícula de mercuri d'ús comú, i amb l'elèctrode de pel·lícula de bismut desenvolupat abans pel nostre grup, el nou elèctrode proposat ofereix un notable funcionament per a l'anàlisi de metalls pesants en traces, la qual cosa pot ser un avantatge en electroquímica, oferint una major aplicabilitat de tècniques electroquímiques per redissolució relacionades amb elèctrodes "sense mercuri".

A més d'aplicacions ambientals, l'elèctrode amb bismut desenvolupat té especial interès per detectar punts quàntics (QDs) basats en metalls pesants. El nostre grup d'estudi per a la detecció de DNA estudia actualment aquestes possibles aplicacions.

Altres capítols de la tesi es van dedicar al desenvolupament de nous sensors de DNA i proteïnes basats en la mateixa tècnica electroquímica de redissolució, així com al ús de nanopartícules d'or (AuNPs) com a marques.

Avui dia, la detecció electroquímica de seqüències de DNA específiques mitjançant l'esdeveniment d’hibridació ha permès proposar diverses estratègies. En aquesta tesi també es van desenvolupar genosensors electroquímics d'afinitat, basats en el marcatge amb AuNPs i l'ús de partícules paramagnètiques (MB) com a plataforma per immobilitzar la sonda de DNA de captura. L'objectiu d'aquests tipus de sensors va ser demostrar la inducció magnètica eficaç d’un nou mètode de grafit-epoxi composite-magnètic (M-GECE), fabricat també amb pasta de grafito-exposi composite, i amb un petit imant de neodimi integrat (ver Figura 2-A).

A més dels avantatges del seu ús com a plataforma de captura, les MB poden separar-se d'altres espècies simplement aplicant una força magnètica durant un temps molt curt (~30 s), en contrast amb el temps de processos convencionals de bioseparació com la cromatografia o la centrifugació (que poden demorar-se a unes hores).

Tots els assajos per a la detecció electroquímica de la hibridació de l'ADN desenvolupats en aquesta tesi doctoral, es van basar en la detecció directa de les AuNPs usades com marca mitjançant la tècnica de voltamperometria de pols diferencial (DPV) usant el M-GECE. En aquesta tècnica, la intensitat del corrent del senyal generat és directament proporcional a la quantitat de l'ADN en la mostra.

Com també es va demostrar amb el sensor de DNA assistit magnèticament, el DNA assenyalat com a objectiu va guiar cap a un senyal molt definit, mentre que al DNA no complementari no se'n va observar cap. Per altra banda, aquest genosensor permet identificar errors de seqüència d'un a tres, a la base del DNA objectiu.

Amb el AuNPs com a marca i MB com a plataforma es va desenvolupar també un nou assaig immunològic electroquímic sensible. El mètode va ser avaluat per un assaig immunològic no competitiu d'una IgG humana com a proteïna model. La detecció electroquímica es va desenvolupar de la mateixa manera que amb el DNA (ver Figura 2-B).

Els assajos aplicats en aquesta tesi demostren que l'ús de MB ofereix avantatges sense precedents per a aquest tipus de detecció, perquè les partícules paramagnètiques són suficientment robustes i es poden rentar diverses vegades en condicions moderadament rigoroses, la qual cosa els dona la capacitat de remoure eficaçment espècies no específiques que poden afectar la resposta del sensor.
La detecció electroquímica de AuNPs com a marca als biosensors d'afinitat, utilitzant mètodes de redissolució, permet estudiar amb detall la hibridació de DNA, així com les immunoreaccions amb interès per a aplicacions relacionades amb genosensors o immunosensors.

Els mètodes electroquímics utilitzats per a la detecció d'AuNPs com a marca, poden ser molt prometedors si es considera la seva alta sensibilitat, el seu baix límit de detecció, la seva selectivitat i simplicitat, el seu baix preu, així com la disponibilitat d'instruments portàtils.

Com a conclusió final, aquesta tesi assenyala que les estratègies d'anàlisi electroquímica de DNA i de proteïnes poden ser utilitzades de manera eficaç en mostres reals, degut als resultats prometedors demostrats amb elles. Els biosensors de DNA i els immunosensors tenen un bon potencial d'aplicació, sobretot per a diagnòstic clínic i monitoratge ambiental, entre altres àmbits. 

Figura 2. Representacions esquemàtiques (sense escala) de: A) el sistema model i protocol analític per a hibridació i detecció electroquímica de DNA, i B) el sistema "sandwich" per a la detecció electroquímica de proteïna. Ambdós sistemes es basen en l'ús de nanopartícules d'or.