Microscòpia Òptica (OM)

Adquisició d’imatges de fluorescència amb càmera.

La lupa estereoscòpica permet l’observació de mostres voluminoses ja sigui amb llum transmesa, reflectida, polaritzada o bé per fluorescència.

L’observació de mostres per confocal permet l’obtenció d’imatges amb alt nivell de contrast i nitidesa.

Gràcies al pinhole, el confocal permet captar només la llum que prové del pla que està en enfoc, de manera que es poden generar seccions òptiques per tal d’obtenir la informació en volum. Aquest tipus de captacions són útils tant per a demostrar la posició relativa d’estructures, com per a fer una reconstrucció tridimensional a posteriori. Aquesta reconstrucció pot tenir una finalitat qualitativa o quantitativa.

El confocal permet analitzar l’emissió de la mostra per tal d’extreure’n l’espectre idiosincràtic. Aquest tipus d’adquisició permet la caracterització d’autofluorescències, anàlisi de canvis d’emissió, etc.  

Captacions d’un pla o d’un volum en el temps que permet l’estudi de dinàmiques cel·lulars o d’orgànuls. És molt important que l’usuari tingui coneixement de l’escala temporal en el que es dona l’esdeveniment per tal de poder ajustar l’equip.
Peu de foto: Cèl·lules que mostren l’increment d’expressió d’EGFP al llarg de 24h. Crèdit: Provital, S.A.
  

Les captacions temporals permeten l’estudi de dinàmiques iòniques. És molt important que l’usuari tingui coneixement de l’escala temporal en el que es dona l’esdeveniment per tal de poder ajustar l’equip.

Peu de foto: Estudi de dinàmiques de calci. Crèdit: Nour al Hoda Al Bast & Carme Nogués, Departament de Biologia Cel·lular, UAB.

Adquisició d’imatges de fluorescència amb alta resolució gràcies al mòdul d’Airyscan, que permet arribar a una resolució lateral de 120 nm i axial de 350nm (mostra depenent).

Dos dels confocal dels que disposa el SM estan equipats amb platines motoritzades que permeten cartografiar les mostres. A partir d’unes coordenades l’equip captarà automàticament tota l’àrea definida. Per altra banda, les platines motoritzades també permeten definir punts d’interès (coordenades) a la mostra i poder-los recuperar.

FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy): Aquesta tècnica permet obtenir una imatge basada, no en l’espectre d’emissió ni en la intensitat del fluoròfor, sinó en les diferències en el temps de vida mitja de cada un. Aquesta tècnica és especialment útil per poder distingir un marcatge específic en una mostra que sigui molt autofluorescent en el mateix rang d’emissió. 

FRET (Förster Resonance Energy Transfer): és un mecanisme que permet descriure l’energia transferida entre dues molècules sensibles a la llum. Un fluoròfor donador, quan s’excita amb una font de llum, és capaç de transferir la seva energia a una fluoròfor acceptor. L’eficiència d’aquesta transferència d’energia depèn de la distància entre aquestes 2 molècules, fent-la molt sensible a petits canvis. Per tant, aquestes mesures de FRET poden ser utilitzades per estudiar interaccions entre proteïnes, per mesurar fluïdesa de membranes, per estudis de vies de senyalització, entre altres.

FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy): és l’anàlisi de la correlació de les fluctuacions en les intensitats de fluorescència. Una de les aplicacions més interessants d’aquest anàlisi és el càlcul de les fluctuacions de concentració de molècules fluorescents en suspensió.
Anisotropia: és el fenòmen on la llum emesa per un fluoròfor té diferents intensitats al llarg dels diferents eixos de polarització. Aquesta tècnica pot ser utilitzada per mesurar cinètiques de reaccions que causen un canvi en la rotació de les molècules. 

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching): és una tècnica utilitzada per estudiar la mobilitat de molècules a través de cèl·lules vives o teixits. És especialment útil en estudis biològics de difusió de proteïnes i molècules lipídiques individuals a través de membranes cel·lulars.

Fotoactivació i Fotoconversió: aquests dos processos permeten fer un seguiment del moviment i el comportament de diverses proteïnes dins la cèl·lula o de diverses cèl·lules dins un teixit. Són molt útils en l’àmbit sobretot de la biologia cel·lular, per exemple, en estudis de dinàmica mitocondrial en cèl·lules vives.

La tècnica de l’excitació dos fotons es basa en l’absorció simultània de dos fotons per part d’un sol fluoròfor, de manera que, si l’energia d’un fotó és inversament proporcional a la seva longitud d’ona, la longitud d’ona dels dos fotons serà dos vegades superior, el que permetrà tenir una major penetració en la mostra. Aquesta tècnica és útil sobretot per visualització d’imatges 3D voluminoses.

TIRFM permet assolit imatges amb una elevada resolució axial, del voltant de 100 nm, i degut al seu rang de treball permet l’estudi de processos associats a membrana.

Peu de foto: Cèl·lules HeLa marcades amb ConcanavalinaA-488. Crèdit: Servei de Microscòpia, UAB  

Realització d’immunomarcatges en cèl·lules i teixits. Els anticossos primaris seran proporcionats pels usuaris.

Mitjançant diferents programes d’imatge es pot fer el processat d’imatges captades amb els equips per tal de millorar la imatge original o bé ajustar-la per tal de presentar-la de manera òptima. També hi ha a disposició programes per a l’anàlisi i quantificació per tal d’obtenir informació quantitativa de les mostres.