Seqüenciació DNA Sanger

• La seqüenciació automàtica de DNA desenvolupada per Applied Biosystems utilitza la metodologia de Sanger amb una polimerasa termostable que permet una reacció de seqüenciació cíclica. 
• El producte de la reacció es separa per electroforesi capil·lar. El marcatge dels fragments es realitza amb 4 fluorocroms (un per cada base). Aquests fluorocroms poden estar incorporats en el primer,"dye primer kit", o bé en els ddNTPs o terminadors, "dye terminator kit". 
• El DNA a seqüenciar ha de ser de la màxima qualitat possible, i es pot partir de: productes de PCR, plasmidis o fags. Els primers que s’han d’emprar per a la seqüenciació cíclica poden ser els específics de cada producte de PCR o bé els universals dels plasmidis o fags. 

Equip: Seqüenciador ABI3500 Genetic Analyzer 

Kits: Big Dye Terminator 1.1 i Big Dye Terminator 3.1

 

L'SGiEB disposa dels primers següents: 

M13univ: 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' 

M13rev: 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' 

SP6: 5'-GAT TTA GGT GAC ACT ATA G-3' 

T7: 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3' 

T7term: 5'-GC T AGT TAT TGC TCA GCG G-3' 

T3: 5'-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3' 

Condicions de les mostres per Seqüenciar:

Mostres	Condicions
Electroforesi de les mostres pre-seqüenciades pels usuaris.	El DNA es pot dur sec o resuspès en aigua en tubs de 1,5 ml o 0,2 ml. Més de 16 mostres, millor dur-les en placa 96 o tubs de 0.2ml
Reacció de seqüenciació i posterior electroforesi	El DNA ha d’estar en aigua. Es necessiten 20 ng totals per productes de PCR purificats i 100 ng totals en plasmidis.  El primer també ha d’estar en aigua a una concentració de 5 µM (1µl/reacció)
Purificació de producte de PCR banda única	Podem purificar banda única amb ExoSap-IT (5µl del producte de PCR)
Purificació de banda d’agarosa	Tub de 1.5 ml amb la banda d’agarosa